Ang Chromatography ay isa sa mga paraan para sa paghihiwalay ng mga substance. Ginagamit ito para sa kasunod na pagsusuri ng husay at dami ng pisikal at kemikal na mga katangian ng microparticle. Ang isang pagkakaiba-iba ng teknolohiyang ito ay affinity chromatography. Ang ideya ng pagkakaiba-iba ng mga compound ng protina gamit ang pag-aari ng molecular affinity ay kilala sa agham sa loob ng ilang dekada. Gayunpaman, natanggap nito ang pag-unlad nito lamang sa mga nakaraang taon, pagkatapos ng pagpapakilala ng mataas na buhaghag na hydrophilic na materyales na ginamit bilang isang matrix. Ang pamamaraang ito ay nagbibigay-daan sa paglutas ng parehong mga analytical na problema (paghihiwalay ng mga sangkap at pagkakakilanlan ng mga ito) at mga problema sa paghahanda (pagdalisay, konsentrasyon).
Essence
Ang Affinity chromatography (mula sa salitang Latin na affinis - “katabing”, “kaugnay”) ay nakabatay sa mga pakikipag-ugnayan ng affinity, na ang pagbuo ng lubos na partikular na mga bono sa pagitan ng isang spacer molecule (ligand o affinant) at isang target na molekula. Ang mga mekanismong ito ay laganap sa kalikasan (koneksyon ng mga tagapamagitan o mga hormone at mga receptor, antibodies atantigens, hybridization ng polynucleotides at iba pang uri ng mga proseso). Sa medisina, ang affinity chromatography ay ginagamit para sa mga praktikal na layunin mula noong 1951
Ang mga bahagi ay pinaghihiwalay gaya ng sumusunod:
- gumaganang solusyon na naglalaman ng substance na ihihiwalay ay ipinapasa sa sorbent;
- Ang ligand na idineposito sa sorbent matrix ay nagpapanatili ng sangkap na ito;
- ito ay puro (akumulasyon);
- pagkuha ng nakahiwalay na substance mula sa sorbent sa pamamagitan ng paghuhugas gamit ang solvent.
Ang paraang ito ay nagbibigay-daan sa iyong ihiwalay ang buong mga cell. Ang pagkakaiba sa tradisyonal na sorption chromatography ay mayroong isang malakas na biospecific na pagbubuklod ng nakahiwalay na bahagi sa sorbent, na nailalarawan sa pamamagitan ng mataas na selectivity.
Adsorbents
Ang mga sumusunod na substance ay ginagamit bilang adsorbents:
- Gel compounds batay sa agarose, isang polysaccharide na nakuha mula sa agar. Ang pinakakaraniwang ginagamit ay 3 varieties: sepharose 4B, CL (cross-linked agarose) at affi-gel. Ang huling komposisyon ay isang binagong gel ng agarose at polyacrylamide. Ito ay may higit na biological inertness, mataas na chemical at thermal resistance.
- Silica (silica gel).
- SALAMIN.
- Mga organikong polimer.
Upang alisin ang mga mekanikal na balakid sa panahon ng pakikipag-ugnay sa ligand, ginagamit ang mga karagdagang substance para ihiwalay ito sa carrier (peptides, diamines, polyamines, oligosaccharides).
Kagamitan
Affinity chromatography equipment ay kinabibilangan ng mga sumusunod na pangunahing unit:
- storage tank para sa mobile phase (eluent);
- mga high pressure na bomba para sa katamtamang supply (pinaka madalas na reciprocating);
- filter para sa paglilinis ng mga eluent mula sa alikabok;
- dosing device;
- chromatographic column para sa mixture separation;
- detector para sa pag-detect ng mga hiwalay na bahagi na umaalis sa column;
- chromatogram recorder at microprocessor unit (computer).
Upang mabawasan ang dami ng natutunaw na hangin, ang helium ay unang ipinapasa sa mobile phase. Upang baguhin ang konsentrasyon ng eluent, maraming mga bomba na kinokontrol ng programmer ang naka-install. Ang mga chromatographic column ay gawa sa hindi kinakalawang na asero (para sa mas mataas na mga kinakailangan para sa corrosion resistance), salamin (unibersal na opsyon) o acrylic. Para sa mga layunin ng paghahanda, maaaring mag-iba ang diameter ng mga ito mula 2 hanggang 70 cm. Sa analytical chromatography, ginagamit ang mga microcolumn na Ø10-150 µm.
Upang mapataas ang sensitivity ng mga detector, ang mga reagents ay ipinapasok sa mixture, na nag-aambag sa pagbuo ng mga substance na sumisipsip ng mas maraming sinag sa ultraviolet o nakikitang rehiyon ng spectrum.
Methodology
Mayroong 2 pangunahing uri ng liquid affinity chromatography:
- Column, kung saan ang column ay puno ng isang nakatigil na yugto at ang isang timpla ay dumaan dito na may daloymaliwanag. Maaaring mangyari ang paghihiwalay sa ilalim ng presyon o sa ilalim ng grabidad.
- Manipis na layer. Ang eluent ay gumagalaw kasama ang flat adsorbent layer sa ilalim ng impluwensya ng mga puwersa ng capillary. Ang adsorbent ay inilalapat sa isang glass plate, ceramic o quartz rod, metal foil.
Ang mga pangunahing yugto ng trabaho ay kinabibilangan ng:
- paghahanda ng adsorbent, pag-aayos ng ligand sa carrier;
- pagpapakain ng separation mixture sa chromatographic column;
- mobile phase loading, component binding by ligand;
- phase replacement upang ihiwalay ang nakagapos na substance.
Destination
Ang affinity chromatography ay ginagamit upang ihiwalay ang mga sumusunod na uri ng substance (ang uri ng ligand na ginamit ay nakasaad sa mga bracket):
- analogues ng enzymatic inhibitors, substrates at cofactor (enzymes);
- bioorganic substance na may mga palatandaan ng genetic alienness, mga virus at mga cell (antibodies);
- high molecular weight carbohydrates, monosaccharide polymers, glycoproteins (lectins);
- nuclear proteins, nucleotidyltransferases (nucleic acids);
- receptor, transport proteins (bitamina, hormones);
- protein na nakikipag-ugnayan sa mga cell membrane (mga cell).
Ginagamit din ang teknolohiyang ito upang makakuha ng mga immobilized enzymes, at ang pagbibigkis sa kanila sa cellulose ay nagbibigay-daan sa paggawa ng mga immunosorbents.
Chromatography ng DNA-binding proteins
Isolation ng DNA-binding proteins ay isinasagawa gamit angheparin. Ang glycosaminoglycan na ito ay may kakayahang magbigkis ng malawak na hanay ng mga molekula. Ang affinity chromatography ng mga protina ng pangkat na ito ay ginagamit upang ihiwalay ang mga sangkap gaya ng:
- mga kadahilanan ng pagsisimula at pagpapahaba ng pagsasalin (synthesis ng nucleic acid molecules at proteins);
- restrictases (mga enzyme na kumikilala ng ilang sequence sa double-stranded DNA);
- DNA ligases at polymerases (mga enzyme na nagpapagana sa pagsasama ng dalawang molekula upang bumuo ng bagong kemikal na bono at kasangkot sa pagtitiklop ng DNA);
- serine protease inhibitors na gumaganap ng mahalagang papel sa immune at inflammatory process;
- growth factor: fibroblast, Schwann, endothelial;
- protein ng extracellular matrix;
- mga receptor ng hormone;
- lipoproteins.
Dignidad
Ang paraang ito ay isa sa pinakaspesipiko para sa paghihiwalay ng mga reaktibong compound (mga enzyme at mas malalaking aggregate - mga virus). Gayunpaman, ginagamit ito hindi lamang upang ihiwalay ang mga biologically active substance.
Detection ng antibodies sa maliliit na dami, quantitative assessment ng polyadenylic acid, mabilis na pagtukoy ng molecular mass ng dehydrogenases, pag-alis ng ilang mga pollutant, pag-aaral ng kinetics ng activation ng hindi aktibong anyo ng trypsin, ang molekular na istraktura ng tao interferon - hindi ito ang buong listahan ng mga pag-aaral kung saan ginagamit ang affinity.chromatography. Ang paggamit sa klinika ay dahil sa mga pakinabang nito tulad ng:
- Epektibong kakayahan sa paglilinisprotina, polysaccharides, nucleic acid. Bahagyang naiiba ang mga ito sa kanilang pisikal at kemikal na mga katangian at nawawalan ng aktibidad sa panahon ng hydrolysis, denaturation at iba pang uri ng paggamot na ginagamit sa ibang mga pamamaraan.
- Ang bilis ng paghihiwalay ng mga substance, ang dynamic na katangian ng proseso.
- Hindi na kailangan para sa espesyal na paglilinis ng enzyme at homogenization ng isoenzyme upang matukoy ang mga constant ng dissociation.
- Nakapaghiwalay ng malawak na hanay ng mga substance.
- Mababang pagkonsumo ng mga ligand.
- Posibilidad ng paghihiwalay ng mga substance sa malalaking volume.
- Mababalik na proseso ng nagbubuklod na biological macromolecules.
Ang diskarteng ito ay maaaring isama sa iba, upang magpataw ng karagdagang field (gravitational, electromagnetic). Nagbibigay-daan ito sa iyong palawakin ang mga teknikal na kakayahan ng chromatography.
Enzymatic engineering
Salamat sa pamamaraang ito, nagsimula ang aktibong pagbuo ng isang bagong sangay ng biotechnology - enzyme engineering.
Affinity chromatography para sa enzyme isolation ay may mga sumusunod na pakinabang:
- pagkuha ng mga enzyme sa malalaking dami bilang resulta ng mas kaunting oras, bilang resulta - ang kanilang pagbabawas sa presyo;
- Ang immobilization ng mga enzyme ay maaaring makabuluhang mapalawak ang saklaw ng kanilang aplikasyon sa medisina at industriya;
- Ang pagkakaugnay ng mga enzyme na may hindi matutunaw na solidong suporta ay ginagawang posible na pag-aralan ang impluwensya ng microenvironment at ang direksyon ng mga reaksyon, na gumaganap ng mahalagang papel sa natural at pisyolohikal na proseso.
