Ang PCR, o polymerase chain reaction, ay isang sopistikadong pamamaraan sa laboratoryo na malawakang ginagamit sa medisina at iba pang siyentipikong larangan. Ang mga diagnostic ng PCR sa isang pagkakataon ay naging isang tunay na tagumpay sa agham.
Paglalarawan
Ang Quantitative PCR ay isang uri ng real-time na PCR.
Ito ay nauunawaan bilang isang variant ng PCR, kung saan ang mga kinetics ng reaksyon ay patuloy na naitala, na ginagawang posible upang masuri nang husay ang nilalaman ng mga partikular na DNA nucleotide sequence sa isang kumplikadong molecular mixture.
Quantitative PCR method ay tatalakayin nang mas detalyado sa ibaba.
Ang esensya ng pagsusuri
Ang mga kultural at serological na pamamaraan ay kadalasang ginagamit upang masuri ang mga impeksyon. Sa ilalim ng una, tinutukoy ang mga antibodies sa isang nakakahawang pathogen sa serum ng dugo. Sa pangalawa, ang biological na materyal na kinuha mula sa isang taong may sakit ay ginagamit upang maghasik ng isang tiyak na daluyan na kanais-nais para sa paglago ng mga kolonya ng pathogen. Diagnostics sa parehoang kaso ay maaaring tumagal ng mga araw o linggo.
Ang PCR na pagsusuri ay maaaring isagawa gamit ang iba't ibang biological na materyales na nakukuha sa isang taong may sakit. Ang dugo at iba pang pathological, physiological at biological na media at mga likido ay kumikilos bilang mga sample. Maaari kang gumawa ng PCR feces o ihi.
Ang mga hindi tipikal at viral na impeksyon ay kadalasang nasusuri sa pamamagitan ng quantitative PCR, dahil maaaring hindi madaling ma-diagnose ang mga ito dahil sa partikular na katangian ng proseso ng pathological na dulot ng mga ito. Upang matukoy ang mga naturang impeksyon, nangangailangan ng oras, kung saan nagsisimula ang paggawa ng mga antibodies sa katawan, na tinutukoy ng mga pamamaraan ng serological. Ngunit hindi ito katanggap-tanggap sa ilang pagkakataon.
Paraan ng pagsasagawa
Paraan ng PCR - pagtuklas ng impeksyon sa laboratoryo sa mga sample na nakahiwalay sa pasyente (in vitro).
Upang magsagawa ng polymerase chain reaction, isang set ng mga espesyal na reagents ang kailangan.
Ang test material ay ipinapasok sa mga test tube na may mga reagents. Ang mga test tube ay inilalagay sa isang espesyal na apparatus - isang PCR amplifier, na idinisenyo upang palakihin (pataasin ang bilang) ng nais na RNA o DNA fragment, ang PCR amplifier ay nagpapatakbo sa isang cyclic mode. Sa anumang cycle, kung ang mga sample ay naglalaman ng RNA o DNA sequence ng pathogen, kung gayon parami nang parami ang mga kopya ng mga particle ng mga nucleic acid na ito na naipon sa solusyon. Maaari mong matukoy ang presensya ng pathogen, at ang dami nito sa mga sample.
Mga Uri ng PCR
Binibigyang-daan ka ng Qualitative analysis ng PCR na makuha ang sumusunod na resulta:
- negatibo kapag ang pathogen ng interes ay hindi nakita sa mga sample;
- positibo kung ang mga sequence ay makikita sa mga sample na katangian ng isang partikular na pathogen.
Sa isang positibong resulta ng PCR, maaari tayong magsalita nang may 95% na katumpakan tungkol sa pagkakaroon ng natukoy na impeksiyon. Kasabay nito, ang katumpakan ng mga PCR set na ginagamit para sa mga layunin ng diagnostic ay umaabot sa 100%.
Karaniwang 5% ng mga maling resulta ay tinutukoy ng human factor. Halimbawa, ang mga paglabag sa pamamaraan ng pagsusuri at pag-iimbak ng mga reagents ay maaaring makabuluhang bawasan ang katumpakan ng pag-aaral.
Ang Quantitative PCR ay tumutukoy sa konsepto ng viral load. Posibleng matukoy kung ilang set ng pathogen DNA ang nasa mga sample na kinuha mula sa pasyente.
Ang kalubhaan ng impeksyon ay direktang proporsyonal sa pagtaas ng kanilang bilang. Maaari mo ring matukoy ang tagumpay ng therapy upang mabawasan ang viral load.
Pagsusumite para sa PCR biomaterial
Quantitative PCR ay isinasagawa sa klinika, pangunahin sa umaga. Sa isang pagbisita sa doktor, sasabihin sa pasyente kung ano ang kailangang kunin: pag-scrape, smears, ihi o dugo. Maaaring makakita ng mga pathogen ang PCR anuman ang antas ng kontaminasyon ng materyal.
Para sa isang positibong pagsusuri, sa teorya, ang pagkakaroon lamang ng isang pathogen sa mga sample ay kinakailangan. Sa pagsasagawa, sinusubukan nilang lumikha ng mas kanais-nais na mga kondisyon. Mayroong ilang mga rekomendasyon para dito:
- kung kukuha sila ng scraping o pamunas mula sa ariorgan, kailangan mong umiwas sa pagtatalik tatlong araw bago ang pag-aaral;
- hindi ka maaaring mag-douche ng mga antibacterial na gamot o maghugas ng sarili bago ang pagsusuri;
- tatlong oras bago kumuha ng smear mula sa urethra, kailangan mong maging matiyaga at huwag alisan ng laman ang iyong bituka.
Huwag sundin ang mga panuntunang ito kapag nag-donate ng dugo.
Paano binibigyang-kahulugan ang mga resulta ng quantitative PCR analysis?
Quantitative evaluation ng mga resultang nakuha
Sa isang bilang ng mga klinikal na sitwasyon, lumilitaw ang problema sa pagiging epektibo ng paggamot at / o ang dinamika ng proseso ng patolohiya. Ang mga ganitong tanong ay partikular na nauugnay kapag sinusuri ang mga taong may malalang impeksiyon (human immunodeficiency virus, hepatitis B at C). Kapag nag-diagnose, nakabatay ang mga ito sa katotohanan na ang akumulasyon ng mga amplicon (mga produkto ng PCR) ay proporsyonal sa pagkakaroon ng mga kopya ng gustong gene sa nasuri na sample.
Siyempre, isinasaalang-alang ang mga resulta ng quantitative PCR ay ginagawa ng gel electrophoresis sa pag-aaral ng intensity ng mga espesyal na signal ng PCR. Gayundin, ang isang kinakailangan para sa isang tamang quantitative assessment ng mga resulta na nakuha ay positibong maaasahang control sample na naglalaman ng isang kilalang bilang ng mga kopya ng nais na gene (halimbawa, isang libong kopya ng hepatitis C gene para sa isang PCR reaction). Ang ilang mga serial dilution ng quantitative control ay nagbibigay-daan sa mga calibration curves na mabuo at ginagamit upang suriin ang nilalaman ng mga klinikal na genocopies sa mga klinikal na specimen.
Sa kahulugan ng quantitative PCR, isang pangunahing tagumpay ang paglikhafluorescent DNA probe na idinagdag sa reaction mixture nang sabay-sabay sa mga simpleng primer at nagbibigay-daan sa iyong subaybayan ang proseso ng PCR sa oras, iyon ay, real-time na PCR.
Ang pamamaraan ng TaqMan ay tumutukoy sa synthesis ng fluorescent DNA probe na partikular sa gitnang bahagi ng amplicon at may dalawang label sa mga dulo. Ang isa sa mga ito ay isang fluorescent label, ang pangalawa ay isang quencher molecule para sa fluorescence na ito.
Ang isang espesyal na device, na isang hybrid ng isang fluorimeter at isang thermoblock-amplifier, ay gumagawa ng patuloy na pagsukat ng fluorescence sa bawat test tube (real-time na prinsipyo ng PCR). Pagkatapos ng 20-40 cycle ng PCR, ang mga indibidwal na curve ay makukuha para sa bawat sample. Ang bilang ng mga kopya ng gustong gene na nakapaloob sa test sample ay maaaring kalkulahin mula sa mga calibration curves na may mga control sample.
Gayundin, isang mahalagang tampok ng pagpapatupad ng PCR sa pamamagitan ng fluorescent na pamamaraan ay hindi na kailangang magbukas ng mga tubo na may pinaghalong PCR kapag isinasaalang-alang ang mga resulta. Binabawasan nito ang posibilidad ng kontaminasyon sa silid gamit ang mga produkto ng amplification, at hindi na kailangang maglaan ng mga espesyal na lugar ng trabaho para sa electrophoresis.
Ano ang ipinapakita ng quantitative PCR transcript?
Ano ang natutuklasan?
Sa pamamagitan ng isang paraan tulad ng quantitative PCR, ang mga qualitative na pagbabago sa mga gene ay makikita: mga insertion, deletion at point mutations. Ngunit sa ilang namamana na karamdaman, lumilitaw ang mga kaukulang sintomas bilang tugon sa pagbabago sa nilalaman ng ilang partikular na gene.
SalamatAng quantitative analysis ay nagbibigay ng numerical na resulta, kadalasan sa IU / ml. Nangangahulugan ito na sa isang mililitro ng sample ng pagsubok, isang tiyak na bilang ng mga kopya ng RNA o DNA ng pathogen, na sinusukat sa mga internasyonal na yunit, ay natagpuan.
Depende sa magnitude, ang kalubhaan ng impeksyon ay masuri. Karaniwang sinusuri ang dugo upang matukoy ang viral load, dahil malayang gumagalaw ang mga virus sa dugo habang may sakit.
Mga Tampok
May dalawang feature ang quantitative PCR sa isang blood test.
- Isinasagawa ang pagsusuri sa pagkakaroon ng mga primer o deoxyribonucleoside triphosphate, na may label na fluorescent o radioactive na label upang tumpak na matukoy ang nilalaman ng nabuong produkto ng PCR.
- Sa proseso ng PCR, tapusin nang maaga ang reaksyon bago lumabas ang napakaraming produkto ng PCR. Ito ay dahil sa ang katunayan na sa huling yugto ng saturation, kapag mayroong maraming mga produkto ng PCR, ang enzyme mismo at ang mga substrate ay kumikilos bilang ang paglilimita ng mga link ng reaksyong ito. Ang pagtatapos ng susunod na pag-ikot ng PCR sa ilalim ng gayong mga kondisyon ay hindi na nailalarawan sa pamamagitan ng pagdodoble ng bilang ng mga produkto ng PCR, ang mga hindi gaanong halaga ng mga pagkakaiba-iba sa pagitan ng iba't ibang mga sample ay na-level, na medyo malinaw na tinukoy sa mga unang yugto pagkatapos na dumaan sa isang serye ng mga siklo ng reaksyon..
Halaga ng PCR diagnostics
Ang pananaliksik sa PCR ay may halaga, na depende sa kung anong uri ng impeksyon ang susuriin, sa pamamaraan ng pagsusuri at sa materyal ng pagsubok. Upang matukoy ang isang impeksiyon, kailangan mong magbigay sa loob200-800 rubles. May bayad din sa pagkuha ng biomaterial - humigit-kumulang 400 rubles.
