Ang Flow cytometry ay isang cytological research method na ginagamit para sa malalim na pagsusuri ng mga cell. Ang bentahe nito ay pinapayagan ka nitong pag-aralan ang bawat cell nang paisa-isa. Ang ganitong uri ng pagsusuri ay nakakatulong upang suriin ang ilang mga parameter sa daan-daang mga cell sa loob ng ilang segundo. Bilang resulta, ang cytofluorimetry ay itinuturing na isa sa pinakamabilis at pinakatumpak na paraan ng pagsusuri na kasalukuyang magagamit sa mga siyentipiko at clinician.
Principle
Ang prinsipyo ng flow cytometry ay batay sa pagsukat ng light scattering at luminescence (fluorescence) ng mga cell. Ang suspensyon ng cell ay ipinapasa bilang isang stream sa mataas na bilis sa pamamagitan ng cytometer cell, kung saan ito ay irradiated sa isang laser. Ang tinatawag na hydrodynamic focusing ay ginaganap din doon. Ang mekanismo nito ay ang daloy mula sa cell na may pinag-aralan na mga particle sa labasan ay dumadaloy sa panlabas na jet, na may mas mataas na bilis. Bilang resulta, ang mga particle ay nakahanay sa isang ordered chain.
Ang mga pre-cell ay may label na may mga espesyal na fluorescent dyes (fluorochromes). Salamat sa kanila, ang laser beamnakaka-excite ng pangalawang glow. Ang natanggap na mga signal ng ilaw ay nakarehistro ng mga detector. Kasunod nito, pinoproseso ang impormasyon gamit ang mga algorithm ng software na nagbibigay-daan sa iyong bilangin ang mga indibidwal na populasyon ng cell na naiiba sa ilang pamantayan.
Ang pagsasaliksik gamit ang kumbensyonal na mikroskopya ay kadalasang nabigo upang makilala ang pagkakaiba sa pagitan ng iba't ibang mga cell dahil magkapareho ang mga ito. Maaaring magbigay ang Cytofluorimetry ng iba pang data (integridad ng istruktura ng DNA), pag-aralan ang expression ng protina, kaligtasan ng cell.
Dahil ang excitation ng fluorochromes ay nangangailangan ng mga light beam na may iba't ibang wavelength, pati na rin ang iba't ibang uri ng detector, ang mga modernong installation ay nilagyan ng ilang mga detection channel (mula 4 hanggang 30). Ang bilang ng mga laser emitters ay maaaring mula 1 hanggang 7. Ang mga mas kumplikadong device ay nagbibigay-daan sa mga multi-parameter na pag-aaral ng ilang katangian ng mga particle nang sabay-sabay.
Mga kalamangan at kawalan
Ang mga benepisyo ng flow cytometry ay kinabibilangan ng:
- mataas na bilis ng pagpoproseso (pagrehistro ng hanggang 30 libong kaganapan sa 1 segundo);
- posibilidad na pag-aralan ang malaking bilang ng mga cell (hanggang 100 milyon sa isang sample);
- Pag-quantitate ng intensity ng fluorescent light;
- pagsusuri ng bawat cell;
- sabay-sabay na pag-aaral ng magkakaibang proseso;
- awtomatikong paghihiwalay ng data ayon sa mga populasyon ng cell;
- kalidad na visualization ng mga resulta.
Ang isa pang tampok ng teknolohiyang ito ay iyonang nasuri na particle ay maaaring mabahiran ng ilang fluorescent solution. Dahil dito, nagaganap ang isang multi-parameter na pag-aaral.
Kasama sa mga disadvantage ang pagiging kumplikado ng mga teknikal na kagamitan at ang pangangailangan para sa espesyal na paghahanda ng sample.
Cytometers
Ang mga unang device ng ganitong uri ay lumitaw na noong 1968 sa Germany, ngunit naging laganap ang mga ito nang maglaon. Sa kasalukuyan, lahat ng device na gumagana sa paraan ng flow cytometry ay maaaring hatiin sa 2 uri:
- mga device na sumusukat sa fluorescent radiation (dalawa o higit pang wavelength), 10° at 90° light scattering (mababang anggulo at side scatter detector);
- mga device na, bilang karagdagan sa pagsukat ng ilang cellular parameter, awtomatikong nagbubukod-bukod ayon sa mga pamantayang ito.
Ang forward scatter detector ay idinisenyo upang matukoy ang laki ng cell, at ang side scatter device ay nagbibigay-daan sa iyong makakuha ng impormasyon tungkol sa pagkakaroon ng intracellular granules, ang volume ratio ng cytoplasm at ang nucleus.
Ang mga klasikong cytometer, hindi tulad ng mga light microscope, ay hindi nagpapahintulot na makakuha ng larawan ng isang cell. Gayunpaman, sa mga nakaraang taon, ang mga pinagsamang aparato ay binuo na maaaring pagsamahin ang mga kakayahan ng isang mikroskopyo at isang cytofluorimeter. Tatalakayin ang mga ito sa ibaba.
Imaging Cytometers
Para sa mga instrumentong ginagamit sa classical flow cytometry,isang tampok ang katangian: kung ang mga bihirang kaganapan ay nakarehistro sa populasyon ng nasuri na mga cell, kung gayon walang paraan upang masuri kung ano ang kanilang kakanyahan. Ang mga particle na ito ay maaaring alinman sa mga labi ng mga patay na selula o isang bihirang grupo ng mga ito. Sa mga kumbensyonal na device, hindi kasama ang naturang data sa pangkalahatang daloy ng mga kaganapan, ngunit ang mga iyon ang maaaring maging partikular na halaga para sa pagsusuring siyentipiko at klinikal.
Ang bagong henerasyon ng mga imaging flow cytometer ay nagbibigay-daan sa iyong kumuha ng larawan ng bawat cell na dumadaan sa daloy sa detector zone. Madaling makita ito sa pamamagitan ng pag-click sa kaukulang bahagi ng diagram, na ipinapakita sa monitor ng computer.
Mga lugar ng aplikasyon
Ang flow cytometry ay isang unibersal na paraan na ginagamit sa maraming larangan ng medisina at agham:
- immunology;
- oncology;
- transplantology (transplantation ng red bone marrow, stem cell);
- hematology;
- toxicology;
- biochemistry (pagsukat ng acidity sa loob ng cell, ang pag-aaral ng iba pang mga parameter);
- pharmacology (lumikha ng mga bagong gamot);
- microbiology;
- parasitology at virology;
- oceanology (ang pag-aaral ng phytoplankton upang masuri ang estado ng mga anyong tubig at iba pang mga gawain);
- nanotechnology at microparticle analysis.
Immunology
Ang immune system ng tao ay binubuo ng iba't ibang uri ng mga selula. Ang daloy ng cytometry sa immunology ay ginagawang posible upang suriin ang kanilang istraktura at pag-andar, iyon ay, upang maisagawa ang morphofunctionalpagsusuri.
Ang ganitong pananaliksik ay nakakatulong upang maunawaan ang kumplikadong katangian ng kaligtasan sa sakit. Ang mga cell phenotype ay nagbabago bilang isang resulta ng pag-activate ng mga antigen, ang pagbuo ng mga pathologies, at iba pang mga kadahilanan. Maaaring paghiwalayin ng Cytofluorometry ang mga subpopulasyon ng mga immune cell sa isang kumplikadong timpla at suriin ang lahat ng pagbabago ng mga ito sa paglipas ng panahon.
Oncology
Isa sa pinakamahalagang gawain sa oncology ay ang pag-iiba ng mga cell ayon sa kanilang uri. Ang prinsipyo ng pagsusuri sa pamamagitan ng daloy ng cytometry sa oncohematology ay batay sa sumusunod na kababalaghan: kapag ang isang sample ay ginagamot ng isang espesyal na fluorescent dye, ito ay nagbubuklod sa mga cytoplasmic na protina. Pagkatapos ng paghahati sa aktibong proliferating na mga cell, ang nilalaman nito ay bumababa ng kalahati. Alinsunod dito, bumababa nang dalawang beses ang intensity ng luminescence ng cell.
May iba pang mga paraan upang matukoy ang mga dumadami na cell:
- paggamit ng DNA-binding dyes (propidium iodide);
- paggamit ng may label na uracil;
- pagrehistro ng mas mataas na antas ng pagpapahayag ng mga protina ng cyclin, na kasangkot sa regulasyon ng cell cycle.
